細胞趨化實驗--EphA3+ MSCs細胞 對高濃度的IIIA4有負趨向行為
細胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運動。趨化性對細胞的發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。EphA3在間充質(zhì)細胞（eMSCs）中發(fā)現(xiàn)表達，但沒有在其他的血管連接組織有表達。澳大利亞的科研人員發(fā)現(xiàn)在人間充質(zhì)細胞（MSCs）中表達的EphA3能夠在成人血管生成的早期發(fā)揮作用。在研究MSCs細胞對于血管生成的信號相應(yīng)的實驗中， 研究人員使用過表達EphA3的MSCs處于EphA3的一個“興奮劑”IIIA4的一個穩(wěn)定的濃度梯度中，可以觀測到過表達EphA3的MSCs對高濃度的IIIA4有負趨向行為。IIIA4是一個能使EphA3活化的抗體，研究表明IIIA4活化EphA3的MSCs減少了細胞間的聯(lián)系，從而推斷出EphA3對于MSCs的定位有著非常重要的作用。
Hypoxia-Controlled EphA3 Marks a Human Endometrium-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cell that Supports Vascular Growth
C. To, R. Farnsworth, M. Vail, C. Chheang, C. Gargett, C. Murone, C. Llerena, A. Major, A. Scott and P. Janes
PloS one, 2014, 10.1371/journal.pone.0112106
一.實驗材料準備：
● 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時拍照功能
● 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
● 可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統(tǒng)
● 分析軟件：手動分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
● EphA3+ eMSC 細胞
● X-lkd IIIA4抗體
● 細胞趨化載玻片（圖一） （ibidi）
圖一，ibidi 細胞趨化載玻片圖示，如圖所示，細胞種在中間通道，兩邊的儲液池可以放不同的刺激因子，從中間通道的觀測可以得到細胞對刺激因子的趨向性，本例是使用一邊加入X-lkd IIIA4抗體，另外一邊放入培養(yǎng)基作為實驗組，兩邊都放培養(yǎng)基作為對照組。
一.細胞趨化實驗
1.實驗步驟
● 將細胞直接加入ibidi細胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）
圖二，在觀測通道中加入細胞-基質(zhì)膠混合液
● 將細胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待細胞貼壁
● 細胞貼壁后分別在兩邊儲液池中加入60μl的X-lkd IIIA4抗體和無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為細胞趨化實驗（+/-）（圖三）
圖三：加入X-lkd IIIA4抗體（紅色）和無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍色）
● 在兩邊儲液池中均加入60μl的無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對照（-/-）（圖四）
四：加入無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍色）作為空白對照
● 按說明，將通道加液孔塞緊后可以進行圖像采集
● 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點，進行18小時的觀測，每20分鐘采集一張圖片
一.圖像數(shù)據(jù)處理
1.手動細胞軌跡追蹤
● 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
● 導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開始記錄細胞軌跡
● 選擇一個細胞，按照時間點單擊細胞，第一點擊后，會有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點擊，都將在這個新窗口中產(chǎn)生一個該細胞隨著時間的新坐標
● 統(tǒng)計完足夠的細胞軌跡后，保存軌跡坐標表格
● 至少收集30個細胞的軌跡才具有統(tǒng)計學(xué)意義，避免同一細胞追蹤兩次，去除由于凋亡會而不能采集完整的軌跡的細胞
2）全自動細胞軌跡追蹤
使用ibidi的WimTaxis自動分析平臺，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個工作日后，會得到細胞軌跡的坐標表格數(shù)據(jù)結(jié)果。
四、實驗結(jié)果：
圖五：如圖所示，在沒有趨化因子存在時，細胞運動沒有趨向性，顯示出無序性。當X-lkd IIIA4抗體存在時，細胞趨向遠離X-lkd IIIA4抗體濃度高的區(qū)域。具有對X-lkd IIIA4抗體的負趨向性。
滬公網(wǎng)安備31011202005471 
